Gourt Home::Gourt :: Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Принципиальная схема ПЦР
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом, широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.
Проведение ПЦР
С помощью ПЦР амплифицируются короткие (до 10 kbkb (kilo base pair) — тысячи пар оснований, единица измерения длины ДНК) участки ДНК с известными концами.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
- ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
- Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.
- Термостабильная ДНК-полимераза.
- Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).
- Буферный раствор.
ПЦР проводят в термоциклёре — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно, с точностью не менее 0,1°С.
Праймеры
То, какой фрагмент ДНК будет амплифицирован в ходе ПЦР, определяется праймерами. Праймеры — это короткие (обычно 18—30 пар нуклеотидов) синтетические одноцепочечные молекулы ДНК. Они должны быть комплементарны началу и концу того участка ДНК, который нужно амплифицировать.Праймеры будут отжигаться Отжиг () — гибридизация фрагментов ДНКна матрице в начале и конце этого участка и служить затравкой ДНК-полимеразе для синтеза комплементарных матрице цепей (см. ниже). Без праймера полимераза не способна начать синтез ДНК.
Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина сайтов связывания праймера занята. Tm можно приблизительно определить по формуле , где nX — количество нуклеотидов Х в праймере. Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться комплементарен нескольким фрагментам матричной ДНК, что приведет к появлению побочных продуктов. Сверху температура плавления ограничена оптимумом действия полимеразы, активность которой падает при температуре выше 80°С.
Если ДНК-последовательность матрицы известна приблизительно, используют вырожденные праймеры, то есть смесь праймеров, где некоторые нуклеотиды могут чередоваться. Например, фрагмент последовательности праймера может быть таким: ...ATH..., где Н - А, Т или С.
При составлении праймеров следует учитывать следующие соображения:
- GC-состав должен быть 40—60 %.
- Расчётная Tm для праймеров не должна отличаться более, чем на 5°С.
- Температура отжига (см. ниже) выбирается на 4—5°С ниже Tm, однако в каждом случае может потребоваться экспериментальный подбор этой величины.
- Необходимо избегать образования шпилекШпилька — структура на конце молекулы ДНК, в которой она образует дуплекс сама с собой. В месте поворота цепи на 180° образуется «ушко», как у шпильки. и димеровДимер ДНК — молекула ДНК с двухцепочечной структурой. Большинство природных ДНК существет в виде димера.
- На 3'-конец следует обратить особое внимание — он не должен быть комплементарен никаким другим праймерам (в том числе себе самому). Желательно также, чтобы на 3'-конце был гуанин или цитозин.
Ход реакции
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 2).- Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.
- Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин.
- ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10—15 мин.
Разновидности ПЦР
- «Вложенная» ПЦР (Nested PCR)
- «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR)
- ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR,RT-PCR)
- Ассиметричная ПЦР ()
- Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR)
- Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR)
- Touchdown ПЦР (Touchdown PCR)
- ПЦР на колониях ()
- ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК ()
Применение ПЦР
ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.Криминология
ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточного совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (). Поскольку есть небольшая вероятность, что у двух человек отпечатки окажутся похожими, этот метод чаще используется для доказательства невиновности подозреваемого.Установление отцовства
Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключнием случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.
Медицинская диагностика
ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соотетствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы.Клонирование генов
Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов из одного организма и вставки их в другой. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужерожный ген в другой организм. В качестве векоторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или белка. Это называется экспрессией гена. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельком хозяйстве, медицине, и др.Мутагенез
Мутагенез — это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК. Мутагенез широко используют для изучения белков и улучшения их свойств (Directed_evolution). ПЦР позволяет проводить wiki/Site-directed_mutagenesis с использованием пары праймеров, несущих мутацию, а также случайный мутагенез. В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся полимеразой в условиях, понижающих ее специфичность.Ссылки
Литература
- Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X
Сноски
Reacció en Cadena de la Polimerasa | PCR | Polymerase-Kettenreaktion | Polymerase chain reaction | Reacción en cadena de la polimerasa | PĈR | Réaction en chaîne par polymérase | 중합 효소 연쇄 반응 | Reaksi berantai polimerase | Reazione a catena della polimerasi | PCR | PGR | PCR | Polymerase-kettingreactie | ポリメラーゼ連鎖反応 | PCR | Reakcja łańcuchowa polimerazy | PCR | Verižna reakcija s polimerazo | PCR | PCR | پی سی آر | 聚合酶链锁反应
"Полимеразная цепная реакция"