A técnica de Gram baseia-se composição química e integridade da parede celular.

Procedimento

1. Confeccionar o esfregaço;
2. Secar ao ar e fixar em chama;
3. Cobrir a lâmina com cristal violeta;
4. Lavar em água corrente;
5. Cobrir a lâmina com lugol por 2 minutos;
6. Lavar a lâmina;
7. Descorar rapidamente com álcool-cetona;
8. Lavar a lâmina;
9. Cobrir com safranina ou fucsina diluída de gram por 30 segundos;
10. Lavar a lâmina, secar e ler. As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da seguinte forma. O primeiro corante (violeta de genciana ou cristal violeta) penetra na bactéria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A lavagem com álcool-acetona dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a diferenciação com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas. Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).

    Preparação para a coloração

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    Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.

    A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

    A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estructura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzénicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes; os corantes ácidos (são negativos formando sais com catiões) e os corantes básicos (são positivos formando sais com aniões). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria permitindo que esta fique corada. Para reforçar a acção do corante, aumentando a força de ligação deste às estruturas celulares utilizam-se mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fénico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque além da substância corante possuem água para permitir a dissociação iônica do corante, álcool para conservar e ácido fénico que actua como mordente e como bacteriostático evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante aplica-se um diferenciador que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:

    1. O primeiro corante
    2. O mordente
    3. O diferenciador
    4. Água (vai parar a diferenciação)
    5. O segundo corante (vai ser contrastante)

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    • Técnica de Ziehl-Neelsen

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