Terapia genica

Per terapia genica si intende l'inserzione di materiale genetico (DNA) all’interno delle cellule al fine di poter curare delle patologie.
La sua concezione si sviluppò a seguito del grande progresso delle metodiche di biologia molecolare sviluppatesi dagli anni ’80. Tali tecniche consentirono il clonaggio ed il sequenziamento di vari geni. Ciò comportò la precisa identificazione di molte alterazioni geniche in diverse patologie e la capacità, grazie alle tecniche del DNA ricombinante, di modificare microorganismi (come batteri o funghi) per poter far loro esprimere delle molecole d’interesse.
Il passo successivo consistette nella valutazione della possibilità di trasfettare le cellule somatiche d’un individuo avente una malattia genetica con un segmento di DNA contenente l’allele sano. Questo approccio si è successivamente esteso anche alle patologie non mendeliane come tumori, infezione da HIV ed altre patologie in cui non si va a sostituire un gene difettoso ma se ne aggiunge uno che possa mettere in moto un fenomeno terapeuticamente utile.

Tipologie di terapia genica

Esistono due tipologie di terapia genica: quella delle cellule germinali e quella delle cellule somatiche.
La prima si propone di trasfettare le cellule della linea germinale come spermatozoi ed ovociti o le cellule staminali totipotenti dei primissimi stadi dello sviluppo (allo stadio di 4-8 cellule) ,ma attualmente essa non viene messa in pratica sia per ragioni tecniche ma soprattutto per i grandissimi dilemmi etici cui si può andare incontro.
La seconda tipologia, invece, si propone di modificare solamente le cellule somatiche, senza intaccare, quindi, la linea germinale ed oggigiorno essa viene studiata e tentata. La terapia genica delle cellule somatiche, a sua volta, viene suddivisa in due gruppi: la terapia genica ex vivo e quella in vivo.

La terapia genica ex vivo

E’ la tipologia che venne messa in pratica per prima e consiste nel prelievo delle cellule somatiche della persona interessata. Esse, successivamente, vengono messe in cultura in laboratorio. Durante questo tempo esse vengono anche trasfettate con il gene d’interesse, inserito tramite un apposito vettore (spesso vengono usati vettori virali), e successivamente vengono reinfuse o reinmpiantate nel corpo del soggetto. Tale procedura è sicuramente la più lunga delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule d’interesse ed inoltre gode d’una maggior efficienza.
E’ attualmente la modalità più utilizzata ma è riservata solamente a quei casi in cui sia possibile prelevare e mettere le cellule in cultura.

La terapia genica in vivo

Viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere messe in cultura o prelevate o reinfuse come quelle del cervello o del cuore. In questo caso il gene d’interesse viene inserito, tramite un opportuno vettore, nell’organismo direttamente o per via locale o sistemica.

La prima tappa

Affinchè la terapia genica possa venir eseguita è necessario conoscere la patofisiologia della malattia in questione ed identificare gli eventuali geni alterati o coinvolti nel processo o quelli terapeutici. Le metodiche di biologia molecolare e di genetica permettono di ottenere questi risultati in tempi sicuramente più rapidi rispetto al passato. Una volta individuato il gene d’interesse esso viene amplificato, clonato e sequenziato.
In tal modo risulta possibile raccogliere tutte le informazioni necessarie per comprendere la sua funzione e le sue possibilità d’utilizzo.

Tipologie di trasferimento

Una volta che il gene d’interesse viene inserito nella cellula può accadere che esso vada incontro ad integrazione nel genoma cellulare oppure che rimanga esterno formando una particella episomiale.
L’integrazione nel genoma permette la replicazione del gene ed il suo trasferimento alle cellule figlie derivanti dalla duplicazione della cellula madre.
La particella episomiale, invece, non viene interessata dalla duplicazione per cui essa non viene trasmessa alle cellule figlie. E’ possibile ovviare a questa situazione, comunque, associando al gene terapeutico un’origine di replicazione, una sequenza di DNA che permette l’aggancio delle polimerasi cellulari, che fa sì che l’episoma venga trasmesso alle cellule figlie.
Queste tre tipologie di trasferimento possono risultare utili nel trattamento di differenti patologie. Avendo a che fare con malattie genetiche, infatti, bisogna utilizzare un gene che si replichi in maniera stabile per cui lo si deve far integrare nel genoma dell’ospite (per esempio utilizzando un retrovirus) oppure lo si può inserire sotto forma di particella episomiale contenente un’origine di replicazione.
In altri casi, invece, il gene terapeutico è necessario solo per un certo periodo di tempo per cui lo si può aggiungere sotto forma di particella episomiale priva dell’origine di replicazione.

Metodologia del trasferimento genico

La parte decisiva della terapia genica consiste nel metodo da adottare per effettuare il trasferimento del gene terapeutico. I diversi sistemi utilizzati per realizzare questo processo vengono attualmente distinti in virali e non virali.

Il trasferimento non virale

Le metodologie adottate per trasferire il DNA senza ricorrere a virus comprendono: l’iniezione di DNA nudo, l’inserimento tramite liposomi od il bombardamento tramite particelle.
L’iniezione di DNA nudo è la procedura più lineare e più semplice ed inoltre permette di trasferire costrutti genici di grandi dimensioni. Consiste nell’iniettare il gene terapeutico, legato ad un plasmide, direttamente nella cellula tramite l’utilizzo d’una micropipetta. Lo svantaggio di questa metodica consiste nel fatto che bisogna iniettare il DNA in ogni cellula, una per una. Il rendimento, inoltre, è decisamente basso.
I liposomi sono vescicole sferiche la cui parete è composta da un doppio strato fosfolipidico. Usando liposomi cationici è possibile far complessare ad essi il DNA, che a pH neutro cresenta carica negativa. Il complesso DNA-liposoma può fondersi con la membrana cellulare ma nella maggior parte dei casi viene internalizzato tramite endocitosi. Successivamente il DNA viene liberato nel citoplasma, entra nel nucleo e viene espresso. Sfortunatamente questo processo è a bassa efficienza in quanto si è visto che solo lo 0,1% del DNA introdotto viene espresso. Per ovviare a ciò nei liposomi sono state anche inserite proteine ed anticorpi che possano aumentare l’efficace della procedura minimizzando la degradazione del DNA e facilitando il corretto direzionamento della vescicola.
Il terzo metodo consiste nell’utilizzo di particolari strumenti elettrici od ad alta pressione che permettono di inviare nella cellula particelle microscopiche d’oro o di tungsteno ricoperte da DNA. Al momento non esistono studi sull’uomo di questa metodica ma solo su animali.

Il trasferimento virale

Si basa sull’utilizzo d’oppurtuni virus ricombinanti.
I virus hanno un’ottima tendenza ad infettare le cellule ed ad inserirvi il proprio DNA sia integrandolo sia sotto forma d’episoma. Rispetto ai sistemi di trasferimento non virali, quindi, hanno un’efficienza nettamente maggiore. I virus da impiegare, tuttavia, devono godere d’alcune caratteristiche:

le particelle virali ricombinanti, rispetto al wild-type, devono essere difettive rispetto alla replicazione
il virus non deve possedere alcune qualità non desiderabili (tipo produzione di composti tossici od attivazione del sistema immunitario)
vi dev’essere spazio a sufficienza per il gene terapeutico (vincolo di dimensione).

I virus attualmente studiati quali vettori per la terapia genica sono:

I retrovirus

Sono stati i primi virus ad essere studiati nella terapia genica, di cui il capostipite è il virus della leucemia murina che nell’uomo non è associato ad alcuna malattia. Un retrovirus presenta due filamenti di RNA complessati con varie proteine, un capside ed un involucro lipidico, derivato dalla cellula ospite infettata. Esso si lega a specifici recettori situati sulla membrana cellulare, il che innesca un meccanismo che porta alla fusione dell’involucro lipidico virale con quello della cellula. In questo modo il virus viene rilasciato nel citoplasma e successivamente l’RNA viene liberato dall’involucro capsidico e può così fungere da stampo per una DNA polimerasi RNA dipendente (la trascrittasi inversa) che sintetizza, così, un filamento di DNA che, ad opera d’una integrasi virale, viene integrato nel genoma dell’ospite.
Il genoma d’un retrovirus è formato da tre geni: gag, pol ed env.
Gag codifica per le proteine del capside virale che sono responsabili dell’assemblamento del virione e dell’incapsidazione del materiale genetico. Pol codifica per la trascrittasi inversa mentre env è responsabile della sintesi di proteine situate sull’involucro lipidico necessarie per l’interazione con i recettori specifici.
Alle due estremità del materiale genetico virale si trovano sequenze non codificanti dette Long Terminal Repeat (LTR, sequenze terminali ripetute lunghe) contenenti le informazioni necessarie per impaccare l’RNA e formare i virione (segnale di packaging, ψ) e per regolare la trascrizione e l’integrazione del DNA.

Come per tutti i virus ricombinanti difettivi rispetto alla replicazione, devono essere adottati dei sistemi particolari per consentirne un’adeguata produzione.

Produzione di retrovirus ricombinanti.jpg Nel caso dei retrovirus si utilizzano linee cellulari (il più delle volte sono fibroblasti 3T3 murini) trasfettate con un segmento genico contenente i geni gag, pol ed env e le sequenze LTR fatta eccezione per la sequenza di packaging. Le cellule così trasfettate (dette cellule impaccatrici) sono in grado di produrre le proteine virali ma non sono in grado di assemblarle per formare un virione maturo.
Tali cellule vengono poi infettate con un retrovirus contenente le sequenze LTR, quella di packaging ed il gene terapeutico ma non gag, pol ed env. Un simile virus non sarebbe in grado di replicarsi ma utilizzando le cellule impaccatrici esse producono le proteine virali necessarie che a loro volta riconoscono la sequenza di packaging dell’RNA del virus difettivo a vi si assemblano dando origine a virioni maturi infettanti. Utilizzando un simile sistema si possono creare delle linee cellulari in grado di produrre 0,1-1,0 particelle virali per cellula per ora ottenendo un titolo di virus ricombinante compreso tra $10^3$ - $10^7$ particelle infettive per ml di cultura.
L’utilizzo dei retrovirus presenta dei vantaggi quali la loro attitudine all’infezione di numerose linee cellulari, l’elevata efficienza nell’integrazione del gene terapeutico nel genoma.
Gli svantaggi nell’utilizzazione dei retrovirus consistono nella loro labilità che ne rende complessa la procedura di purificazione dal mezzo di cultura. Il genoma retrovirale, inoltre, si può integrare in quello cellulare solo quando la membrana nucleare è assente e di conseguenza solo le cellule replicanti possono esser infettate. Un altro problema deriva dalla casualità dell’integrazione del DNA virale, il che può portare alla disattivazione od attivazione d'alcuni geni con rischio di fenomeni di mutagenesi inserzionale.
E’ da segnalare, infine, che lo spazio la le due sequenze LTR consente l’inserzione d’un gene di lunghezza massima di 8 kb.

I lentivirus

I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo ma a differenza dei precedenti, possono infettare anche cellule non replicanti, il che li rende dei buoni candidati per modificare l’espressione delle cellule a differenzizione terminale, come quelle del cuore o del sistema nervoso centrale, e facilita anche i processi di trasfezione ex vivo in quanto le cellule messe in cultura non abbisognano di stimoli che le inducano a dividersi. Il DNA ottenuto dalla trascrittasi inversa, infatti, si complessa con proteine virali, formando un complesso, detto di preiniziazione, che permette il passaggio attraverso la membrana nucleare. Questo meccanismo, comunque, non è l’unico esistente i quanto è stata individuata una sequenza regolatrice polipurinica centrale (cPPT, central polypurinic tract), situata nel gene della polimerasi, che favorisce la traslocazione nel nucleo cellulare. Recentemente, inoltre, è stato indicato un residuo di valina situato in posizione 165 del gene dell’integrasi quale fattore in grado di favorire l’ingresso nel nucleo in maniera maggiore del cPPT.
Tra i virus considerati è stato anche studiato HIV e ciò ha fatto sì che vi siano stati molti studi volti a costruire vettori e linee cellulari d’impaccamento che impediscano una ricombinazione che ripristini lo stato wild-type.

La costruzione dei vettori virali prevede un genoma modificato che presenti solo le sequenze relative all’integrazione, alla retrotrascrizione ed all’incapsidamento dell’RNA nonché la sequenza di packaging. La linea cellulare, invece, viene trasfettata con due plasmidi: uno di packaging codificante per le proteine capsidiche ed un altro contenente le glicoproteine di superficie in cui la sequenza della proteina gp120 è stata sostituita con quella della glicoproteina G del virus della vescicolostomatite, la quale aumenta le linee cellulari che possono essere infettate e facilita la purificazione dei virioni tramite centrifugazione.
Successivamente al plasmide di packaging sono stati eliminati molti geni lasciando solo gag, pol, tat e rev. E’, infine, seguito l’uso di plasmidi di packaging in cui il gene tat è stato completamente eliminato.
Il rischio potenziale di dare origine ad una particella virale infettiva ed autonomamente replicante ha spinto gli studiosi a dare origine ad un vettore autoinattivantesi (SIN self-inactivating). Quseta tipologia di costrutto si base sul fatto che con la retrotrascrizione vengano perse altre sequenze essenziali alla replicazione. Ciò viene ottenuto eliminando parte dell’ LTR in 5’ ed agganciando ad essa, presso la regione U3 dell’LTR in 3’, vengono delete le sequenze relative alla TATA box e quelle per il legame dei fattori di trascrizione cellulari NF-kβ e Sp1. Tutto questo fa sì che, una volta avvenuta la retrotrascrizione, il DNA prodotto abbia entrambe le sequenze LTR inattive e di conseguenza la trascrizione diviene impossibile mentre il gene terapeutico inserito viene trascritto grazie all’azione d’un promotore interno (tipicamente derivato dal citomegalovirus, CMV). Questo stesso promotore viene agganciato sia alla regione 5’, creando una sequenza ibrida CMV-LTR, sia ai plasmidi con cui la linea cellulare d’impaccamento viene trasfettata, sotituendo completamente le loro sequenze LTR. L’uso della sequenza del CMV favorisce la trascrizione, ovviando all’assenza di tat, e riduce ancora la possibilità che si formi un virione wild-type. L’uso di vettori SIN, inoltre, riduce il rischio di mutagenesi inserzionale in quanto l’assenza d’un LTR funzionale evita l’attivazione d’eventuali protooncogeni situati a valle d’esso.
Al momento, comunque, non sussistono studi sull’uomo che abbiano utilizzato lentivirus ricombinanti.

Gli adenovirus

Gli adenovirus sono virus a DNA a doppio filamento non racchiusi da un involucro lipidico ed a simmetria icosaedrica. Essi nell’uomo sono associati soprattutto ad infezioni del apparato respiratorio. Gli adenovirus utilizzati per la terapia genica appartengono al gruppo C che comprende i sierotipi 1, 2, 5 e 6.
Il ciclo vitale d’un adenovirus comprende un legame a specifici recettori cellulari che permettono l’ingresso del virus tramite endocitosi. L’endosoma viene poi a fondersi con un lisosoma ed il cambio di pH che ne consegue probabilmente favorisce un cambio conformazionale del capside cui segue una demolizione della vescicola e la liberazione del DNA virale che viene trasportato nel nucleo ove rimane in forma episomiale.
Il genoma degli adenovirus è apprissimativamente di 36 kb ed in esso sono individuabili regioni codificanti per geni espressi precocemente (early, E) e tardivamente (late, L). Ai due lati del genoma si trovano le cosiddette sequenze terminali invertite (ITR, Inverted Terminal Repeat) le quali sono necessarie per la replicazione del virus.
Nel nucleo cellulare vengono espressi per primi i geni E1 (detti precoci immediati) che permettono la transattivazione dei geni E2 ed E4 che determinano il blocco della sintesi proteica cellulare e partecipano alla replicazione del DNA virale. Una volta che sia iniziata la replicazione, vengono attivati i geni tardivi che codificano per le proteine strutturali che nel nucleo cellulare si assemblano intrappolando il DNA dell’adenovirus virale. La cellula, successivamente, va incontro a lisi.

Gli adenovirus ricombinanti usati come vettori presentano una delezione almeno della regione E1 il che rende il virus difettivo per la replicazione. Come cellule d’impaccamento vengono usate cellule renali embrionali (cellule 293) che sono state trasfettate con la regione E1. Infettando tali cellule con il virus difettivo si permette la sua replicazione e produzione di nuovi virioni ricombinanti fino ad una resa assai elevata di circa $10^{11}$ - $10^$ particelle/ml.
Generalmente gli adenovirus ricombinanti presentano una delezione sia della regione E1 che di quella E3. Si è visto, però, che talune cellule infettate da questo vettore esprimono i geni rimanenti in basse quantità sufficienti, però, perevocare una risposta citotossica in grado d’eliminarle.
Studi successivi hanno permesso d’ottenere vettori ricombinanti aventi anche una delezione delle regioni E2 o E4 ma ciò ha determinato una riduzione dell’espressione genica.
Attualmente, però, si ottenuta una terza generazione di vettori ricombinanti in cui buona parte dei geni sono stati eliminati e sono rimaste solamente le regioni ITR e la sequenza di packaging a fianco del gene d’interesse. Ciò ha diminuito le problematiche d’iimunogenicità e di sicurezza.
La produzione di questo tipo di virus utilizza le stesse cellule trasfettate con E1 cui poi si aggiunge un virus helper contente tutte le proteine virali tranne E1. Resta, tuttavia, la difficolta d’isolare il virus contenente il gene terapeutico da quello helper e la problematica data dalla risposta immunitaria scatenata dalle proteine del capside a seguito dell’introduzione in vivo.

I virus adenoassociati

I virus adenoassociati appartengono alla famiglia dei parvovirus, hanno un genoma formato da una molecola di DNA a singolo filamento di circa 5 kb, hanno un capside icosaedrico e sono privi d’un involucro lipidco. Al momento non sono stati associati ad alcuna patologia e possono infettare sia cellule replicanti che non.
La denominazione di virus adenoassociati deriva dal fatto che non sono in grado di replicarsi autonomamente ma necessitano d’un altro virus che in genere è un adenovirus od un herpesvirus. In assenza del virus helper il DNA dei virus adenoassociati s’integra in quello della cellula ospite in una regione ben precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-ter).

Il genoma d’un virus adenoassociato è formato da due geni: rep che codifica proteine neccessarie per il controllo della replicazione virale e cap che dà origine alle proteine strutturali del capside. Ai lati del filamento di DNA si trovano lunghe sequenze ITR di circa 145 bp ognuna, necessarie per regolare la replicazione e l’incapsidazione del virus.

Il vettore basato sui virus adenoassociati ricombinanti è costruito sostituendo il gene terapeutico a cap e rep in quanto le sequenze ITR contengono tutt le informazioni necessarie per l’integrazione ed il packaging. La produzione d’un simile vettore la si ottiene trasfettando una linea cellulare (la 293) con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettandola con un adenovirus helper difettivo per E1. Sfortunatamente il virus ricombinante, rispetto al wild-type, non sempre s’integra nel cromosoma 19 e talvolta resta episomiale. I virus adenoassociati, inoltre, non elicitano una risposta immune ma in essi non si possono inserire segmenti maggiori di 4,7 kb.

Gli herpesvirus

Degli herpesvirus, virus a doppio filamento di DNA con capside icosaedrico e presenza d’un involucro lipidico, viene utilizzato il virus herpes simplex di tipo 1 (HSV-1).
Si tratta d’un virus neurotropo in grado d’instaurare un ciclo litico ma anche di persistere sotto forma episomiale nella cellula ospite. Il genoma di HSV-1 è formato da un doppio filamento di DNA di 152 kb che contiene almeno 80 geni.
Non appena inizia il ciclo litico viene espressa la proteina VmW65 che attiva i geni precoci immediati (IP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47) che fungono da fattori transattivanti per gli altri geni precoci che codificano prodotti necessari per la replicazione ed il metabolismo dei nucleotidi. Successivamente vengono attivati I geni tardivi codificanti per proteine strutturali. Il ciclo si conclude con la lisi della cellula.

Per ottenere un HSV-1 vettore sono stati usati due approcci.
Il primo consiste nell’uso d’un amplicone, un plasmide contenente un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli), una di HSV-1 (OriS), la sequenza di packaging di HSV-1 ed il gene da inserire. Il tutto viene inserito in una linea cellulare infettata da un virus helper contenente i geni regolatori e strutturali mancanti.
Il secondo approccio consiste nell’uso d’un virus ricombinante ottenuto eliminando uno o più geni precoci immediati e facendo produrre le particelle da cellule esprimenti le proteine mancanti. Questo approccio è gravato dal fatto che il vettore così prodotto risulta essere neurotossico.

Collegamenti esterni

Thelethon: la terapia genica

Genetica Terapie

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