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Principe de coloration des Gram négatifs
Après fixation des bactéries sur une lame (deux méthodes possibles : fixation à l'éthanol à 90° ou par passage de la lame dans la flamme, dite frottis) :
- La lame est plongée dans un premier colorant : le violet de gentiane. Le violet de gentiane est un colorant puissant, (toxique et cancérigène). Il va traverser les parois et membranes des bactéries et se fixer dans leurs cytoplasmes. Ainsi à cette étape toute les cellules sont colorées en violet.
- La lame est ensuite traitée au lugol (diiode) en solution qui sert de mordant : il va renforcer le violet de gentiane contenu dans le cytoplasme des bactéries.
- On chasse ensuite le violet avec une solution d'éthanol a 90°. Cette étape est cruciale car elle détermine quelle bactérie est gram négatif et quelle bactérie est gram positif. Le princicipe est le suivant : les bactéries gram négatif possédent une paroi pauvre en peptidoglycane, composant qui empêche l'alcool d'emporter le violet de gentiane celui-ci restant dans le cytoplasme. la bactérie est donc décolorée (pour plus d'information, voir les caractèristiques des bactéries gram négatif).
- La lame après avoir été rincée et plongée brièvement dans un deuxième colorant, la fuschine. Ce colorant traverse toutes les parois et membranes et va colorer en rose toutes les bactéries qui ont été décolorées durant l'étape précédente ; les bactériee gram positif étant colorées en violet (plus sombre) n'apparaîtront pas rose (plus clair).
La lame est ensuite récupérée, rincée et séchée, puis observée au microscope optique généralement à l'objectif x100 + huile à immersion. Les bactéries gram négatif apparaîtront en rose. L'observation de leurs couleurs est généralemment accompagnée de descriptions structurelles (ex. bacille ou coque).
Caractéristiques des bactéries gram négatif
Description de l'enveloppe
Les bactéries gram négatif ont une structure qui s'organise en trois grandes parties : (de l'extérieur vers l'intérieur)
- La membrane externe
- L'espace périplasmique et peptidoglycane
- La membrane plasmique
La membrane externe est en contact direct avec le milieu extérieur. Elle est principalement composée de phospholipides organisés en bicouche (partie hydrophile à l'extérieur et partie lipophile à l'intérieur) mais contient aussi de nombreuses protéines intrinsèques, notamment les protéines de transports appelées porines. Beaucoup de gram négatif (ex. Salmonella) possédent aussi un composé non protidique appelé lipopolysaccharide ou LPS ; ce composé peu immunogène, dont le pouvoir pathogène (Lipide A) est inclu dans la membrane externe, s'active lors de la lyse de la bactérie. La membrane externe est reliée au peptidoglycane par la lipoprotéine de Braum.
L'espace périplasmique est un espace de stockage d'enzymes, de nutriments... Il a beaucoup d'autres fonctions notamment dans certaines étapes de la synthèse de protéines et dans le métabolisme. Il se situe entre la membrane externe et la membrane plasmique et il contient une couche de peptidoglycane. La couche de peptidoglycane (appelé aussi muréine) est relativement mince chez les gram négatifs contrairement aux gram positifs.
La membrane plasmique est semblable à la membrane externe (excepté le LPS). Elle possède des proteines poreuses aboutissant dans l'espace périplasmique (synthèse de protéine). La membrane plasmique contient de nombreux autres complexes protéiques d'une importance vitale pour la bactérie (comme l'ATP synthase) qui ont des rôles prépondérants dans le métabolisme bactérien.
Exemples de bactéries Gram négatifs
- Famille des Enterobacteriaceae :
- Genre Salmonella
- Espèce Escherichia coli
- Espèce Yersinia pestis (responsable de la Peste)
- Famille des Vibrionaceae :
- Espèce Vibrio cholerae (responsable du choléra)
Voir aussi
- Les mycobactéries : une exception car non colorable par la méthode de Gram car Acido-alcoolo-résistants.
Gramnegativní bakterie | Gram-negative | Bacteria Gram negativa | Gramnegatiivinen bakteeri | Gram-negatief | Bakterie gram ujemne | 革蘭氏陰性菌
"Gram négatif"