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La biophotonique étudie les processus biologiques en utilisant des molécules fluorescentes comme rapporteurs. Cette technique permet d'étudier la diffusion des protéines et des lipides dans les membranes cellulaires.
Présentation
Technique instrumentale au départ, la microscopie se développe sous des formes nouvelles en s'appuyant sur les avancés de la technologie et de la science. L'excellente résolution du microscope électronique a permis d'affiner notre connaissance de la matière à l'échelle atomique, et d'accéder à des analyses quantitatives d'une extrême précision (micro-analyse). Par la suite, la facilité de construction de sources d'électrons peu étendus et brillantes, ainsi que le balayage de faisceaux d'électrons très focalisés, ont permis la naissance de la microscopie électronique à balayage. Cette notion de balayage avec acquisition successive des points de l'image est maintenant transposée à la microscopie photonique, dite microscopique confocale à balayage laser.
Cette innovation récente résulte de l'association de techniques de pointe en optique, en mircomécanique et en informatique, et permet des applications biologiques comme la détection de molécules uniques pour les tests immunologiques, la génomique et la proteomique.
Concepts physiques utilisés
Principe optique du microscope confocal
Alors que le microscope photonique classique capte simultanément tous les points de l'objet, le microscope à balayage utilise une configuration optique dans laquelle la source est fortement focalisée sur un point qui peut être balayé. L'association de la microscopie confocale au mode d'epifluorescence (donc en lumière réfléchie à l'inverse de la lumière transmise) permet de mesurer point par point la quantité de fluorescence émise par une préparation, et ainsi de réaliser une véritable imagerie microscopique à trois dimensions.
Voir l'article détaillé Microscope confocal à balayage laser.
Pourquoi un microscope confocal
L'équipe « Biophotonique » de l'institut Fresnel (Marseille) étudie la diffusion des protéines et des lipides au sein des membranes cellulaires. De telles études atteignent les limites des possibilités de résolution de l'optique visible. Il faut donc avoir recourt, afin d'avoir une tache de lumière la plus petite possible, à l'utilisation d'un objectif optique capable de capter le plus grand angle de lumière (utilisation d'un objectif de microscope à grande ouverture numérique), pour ensuite la focaliser sur la plus petite surface de membrane.Comment visualiser l'échantillon ?
Afin de visualiser les objets à étudier (protéines membranaires en relation avec le cytosquelette…), il est nécessaire de les marquer avec des molécules fluorescentes, et ce grâce aux techniques classiques de la microscopie de fluorescence (immuno-marquage avec réaction anticorps-antigene). Mais le marquage ne peut être dirigé sur une seule molécule, et au cours de cette opération, toute la population de molécules de même nature, existante au sein de la cellule, va être couplée à un marqueur fluorescent. Ainsi l'objet à étudier, excité par la lumière incidente, va être « noyé » dans un important bruit de fond provoqué par les molécules de même nature, mais situé sur d'autres plans que celui du plan foyer L'idéal étant de n'avoir qu'un seul objet fluorescent au sein du volume d'observation. La limite de cette méthode est donc la difficulté de détection de ce signal, qui doit être le plus faible possible.Que va-t-on enregistrer ?
Ce que l'on va enregistrer, ce sont les fluctuations de fluorescence : ces fluctuations renseignent sur les entrées et les sorties des objets dans le volume d'observation. La durée moyenne de la « bouffée » de photons émis par une molécule marquée est due au coefficient de diffusion de celle-ci (temps de diffusion = l2 * DT). Les objets marqués vont continuellement entrer et sortir du volume d'observation avec un mouvement de type Brownien (aléatoire), créant ainsi des fluctuations de fluorescence qui vont être enregistrées par des capteurs ultrasensibles. Les données sont traitées par informatique et permettent d'établir la fonction d'auto-correlation temporelle, g2 * (T), qui décroît en un temps caractéristique donnant le temps moyen de diffusion de l'objet (de l'ordre de la ms) dans le volume d'observation.Appareillages employés
Le montage a été élaboré et effectué par une équipe de l'institut Fresnel de manière expérimentale, à l'aide de différents composants techniques tel qu'un microscope confocal inversé à fluorescence dont l'éclairage en lumière blanche est fourni par des faisceaux lasers via des fibres optiques monomodes (très grande pureté de la lumière) afin d'assouplir le système. L'échantillon (cellule vivante) est placé sur un cadre porte-lame piézoélectrique, capable d'effectuer des déplacements dans les trois dimensions au nm près ! Dans ce mode de fonctionnement du microscope, confocal, seul le cadre piézoélectrique assure le balayage de l'échantillon par rapport à un laser fixe. Le faisceau laser est tout d'abord agrandi par le jeux de deux lentilles, puis il est réfléchi par un miroir dichroïque afin d'être dirigé vers l'objectif du microscope ou il est condensé pour former le volume d'observation le plus petit possible. La molécule marquée va ainsi être excitée par ce faisceau « d'excitation », et va émettre une fluorescence secondaire qui va effectuer le trajet inverse. Cette nouvelle longueur d'onde (la lumière de réflexion) passe à travers les miroirs dichroïques, puis est captée simultanément par deux photodiodes à avalanche, qui émettent des pulses de 5V enregistrés par l'unité centrale. Celle-ci va ensuite traiter les informations afin d'élaborer la fonction d'auto-corrélation temporelle.
Applications en biologie
La problématique des microdomaines
Il existe au niveau de la cellule des organisations particulières. La membrane biologique, système fluide, serait aussi organisée en domaine; ainsi, des méthodes biochimiques on montré que l'on pouvait purifier à partir de ces membranes des vésicules qui ne sont pas solubles dans certains détergents. Ceci montre que dans une membrane plasmique, il y a des zones de membranes qui ont des compositions lipidiques et protéiques différentes, avec des propriétés biophysiques particulières. On peut donc purifier ces microdomaines. Ces domaines ont une importance dans le contexte de la signalisation cellulaire: la membrane est la zone d'interface de la cellule entre l'intérieur et l'extérieur, ce n'est pas seulement une barrière physique, mais c'est également une zone d'interaction. A l'heure actuelle l'étude des microdomaines n'a pu être réalisée qu'à partir de purification de vésicules à partir de traitements biochimiques. L'autre moyen permettant d'étudier les microdomaines est la microscopie à fluorescence. L'avantage de cette technique est que les cellules placées sous le microscope sont vivantes. On peut donc localiser la membrane et étudier les fluctuations de fluorescence.Modèle utilisé
Le modèle choisi ici, pour étudier les microdomaines sont les molécules « ras » (petites protéines G). Elles sont impliquées dans un grand nombre de régulation membranaire : adhésion, apoptose, signalisation… Dans une cellule, par exemple, on trouve différents isoformes de la famille ras : Ha-ras et Ki-ras. Ces protéines G ont un cycle. D'abord loadée en GDP qui est la forme inactive, puis en GTP pour induire la cascade de signalisation. Une molécule est fixée à un récepteur, activée puis localisée ailleurs pour aller activer toute la voie de la signalisation nécessaire. À l'heure actuelle, la problématique des microdomaines est à son commencement. On sait qu'ils existent, qu'ils sont très inconstants dans la signalisation, mais on ne sait pas comment ils sont formés, comment les protéines sont adressées, comment ils se déplacent spécifiquement sur les membranes, quelle est l'hétérogénéité des microdomaines. L'étude des propriétés de diffusion de ces molécules sur la membrane, est réalisée grâce aux techniques de la biophotonique et du microscope confocal (Fluorescence Correlation Spectroscopy).Positionnement sur la membrane biologique
Avec le microscope confocal, le signal sur la photodiode à avalanche est le signal qui provient du volume confocal. Si l'on scanne l'échantillon en x, y ou en z, on crée une image point par point, le cadre piézoélectrique permet de bouger en x, y, et z l'échantillon. Cela est important pour l'application biologique, il faut placer le volume confocal sur la membrane de la cellule qui ne mesure que quelques nanomètres d'épaisseur. C'est donc nécessaire pour pouvoir se positionner sur la membrane de la cellule ! Pour se positionner sur la membrane il est nécessaire de faire tout d'abord un scanne en 2D (xy), il faut alors localiser le noyau (ceci se fait avec l'expérience car celui-ci est non marqué). À ce niveau un z scanne (de haut en bas) permet de traverser la cellule et de voir apparaître les deux membranes cellulaires qui ont été marquées auparavant. Il y a un pic de fluorescence pour chacune des membranes. On positionne ensuite le microscope au sommet d'une des membranes, c'est là qu'il fera la mesure des fluctuations de fluorescence. Grâce au volume confocal (volume de détection de la membrane qui peut être élargit ou rétrécit) on peut étudier des zones plus ou moins importantes en terme de diamètre de la membrane. Si on regarde à l'intérieur d'un microdomaine, on pourra voir une diffusion aléatoire libre de la protéine. Si on prend un champ plus large contenant un microdomaine, la protéine va rester un certain temps à l'intérieur de ce microdomaine avant de sortir de celui-ci. On enregistre des fluctuations de fluorescence dans ce volume d'observation, on peut mettre en évidence si les molécules que l'on regarde diffusent plus ou moins longtemps dans ce volume d'observation, à partir de là on peut déterminer la taille des microdomaines et la caractéristique de diffusion des protéines, travail en autocorrélation, suivi de la diffusion d'une seule molécule. Modélisation informatique : comment vont évoluer les fonctions de corrélation suivant les différents types de conformation ?
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