La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobretodo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1844. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram-positivas a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram-negativa a las que se visualizan de color rosa.

Protocolo

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Para lograr la coloración primero se diluye la muestra con las bacterias en una gota de agua y después se fija con un calor leve. A continuación se procede a las tinciones/decoloraciones:

• Agregar azul violeta (cristal violeta) y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color morado las bacterias Gram Positivas.
• Enjuagar con agua.
• Agregar lugol y esperar 30 segundos.
• Enjuagar con agua.
• Agregar alcohol y acetona.
• Enjuagar con agua.
• Agregar safranina y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram Negativas.
• Enjuagar con agua.

Explicación

El primer paso en cualquier tinción debe ser siempre la fijación con calor. Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).

El lugol está formado por I₂ (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el iodo. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I₂/cristal violeta. Los organismos Gram-positivos no se decoloran, mientras que los Gram-negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram-negativas. Al término del protocolo, las Gram-positivas se verán azúl-violáceas y las Gram-negatívas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)

Observaciones

• Siempre que se realice el protocolo, es fundamental realizar el tratamiento con cristal violeta antes de hacer el tratamiento con yodo. El yodo, en ausencia del cristal violeta, tiene poca afinidad por las células, por lo cual se pierde en los sucesivos lavados.
• El proceso de decoloración no debe ser extenso, y debe respetarse el protocolo en cuanto al tiempo designado para los mismo. Así mismo, debe utilizarse poca agua para evitar la pérdida de tinción de las Gram-negativas.
• Al trabajar con cultivos de más de 24 horas, no puede garantizarse la integridad de la pared celular de los mismos, y entonces el complejo cristal violeta/yodo puede no ser retenido.

Utilidades

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En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

• Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
• Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación.

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.

También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibriones.

Fundamentos

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Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas

La pared celular de las bacterias Gram-positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram-negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram-positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram-negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram-negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram-positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

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