Bacillus subtilis Gram.jpg Gramfärbung]] Die Gram-Färbung ist eine Methode zur differenzierenden Färbung von Bakterien. Sie ist nach dem dänischen Arzt und Bakteriologen Hans Christian Gram benannt, der sie am Ende des 19. Jahrhunderts entwickelte. Verschiedene Bakterien reagieren auf diese Färbung unterschiedlich. Daraus folgt eine Einteilung in sog.

• grampositive Bakterien, die nach dem Färbegang violett/blau erscheinen, und
• gramnegative Bakterien, die ungefärbt bleiben. (Früher wurden diese noch nachträglich mittels Fuchsin rot gefärbt, jedoch ist dies heute durch Phasenkontrastmikroskope nicht mehr notwendig.)

Dies ist ein wichtiges Kriterium für die Unterscheidung verschiedener Bakterien nach der Struktur ihrer Zellwand.
Bedeutend ist das Färbeverfahren beispielsweise bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten. „Grampositive“ und „gramnegative“ Bakterien reagieren unterschiedlich auf Antibiotika. Mit dieser schnellen diagnostischen Methode kann man in kurzer Zeit (in etwa fünf Minuten) anhand eines Abstriches das „Gramverhalten“ der Bakterien bestimmen. Damit hat man die Möglichkeit, sofort mit einer oft lebensrettenden antibiotischen Therapie zu beginnen, bevor das Ergebnis der oft mehrere Tage dauernden definitiven Keimbestimmung vorliegt.

Methode der Gram-Färbung

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Die Färbung setzt sich aus den drei Stufen Färben-Entfärben-Gegenfärben zusammen. In der ersten Phase wird mit Karbol-Gentianaviolett (eine Lösung von Gentianaviolett mit Zusatz von 15 g/L Phenol) eingefärbt, wodurch alle Bakterien, grampositive wie auch gramnegative, gefärbt werden. Durch eine nachfolgende Behandlung mit Lugol-Lösung bilden sich größere Farbstoff-Komplexe, die Bakterien erscheinen dunkel blau-violett. Die entscheidende zweite Phase bestimmt nun, ob die Bakterien als grampositiv oder gramnegativ zu klassifizieren sind: Die Behandlung mit Alkohol (96% Ethanol) führt dazu, dass gramnegative Bakterien wieder entfärbt werden, während grampositive Bakterien die blaue Farbe nicht mehr verlieren. Der Unterschied ist auf den Aufbau der Zellwand zurückzuführen:

• Grampositive Bakterien besitzen eine dicke, mehrschichtige Mureinhülle (Peptidoglykane), in den Zwischenräumen hat sich die Lugollösung angesammelt. Hier wirkt der Alkohol dehydrierend und verringert den Abstand zwischen den Molekülen, so dass der Farbstoff an Ort und Stelle bleibt.
• Gramnegative Bakterien hingegen besitzen nur eine dünne Mureinhülle, der eine Lipid-Membran aufgelagert ist. Der Alkohol wirkt hier lipidlösend, so daß die dünne Mureinhülle freigelegt wird. Da die Lugollösung hier nicht "in der Tiefe versickert" ist, wird sie mit weggespült - das Bakterium entfärbt.

Die Behandlung mit Alkohol ist der entscheidende Schritt bei der Gramfärbung und erfordert zur sicheren Diagnosestellung einige Erfahrung. Zur Darstellung der Gram-negativen Bakterien können diese abschließend mit verdünntem Karbolfuchsin (eine Lösung von Fuchsin mit Zusatz von 4,5 g/L Phenol, Fuchsin und Phenol etwa 1/10 der üblichen Konzentration) gegengefärbt werden, worauf sie rot erscheinen.

Andere Methoden zur Unterscheidung von grampositiven und gramnegativen Bakterien

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KOH-Test

Eine kleine Menge Bakterienmasse (von einer Agar-Kultur) wird in einem Tropfen KOH-Lösung suspendiert. Bei grampositiven Bakterien führt die konzentrierte Lauge zu keiner Reaktion, zieht man eine Nadel durch das Gemisch, verhält es sich wie eine Flüssigkeit mit einer Viskosität wie Wasser. Die Zellwand von gramnegativen Bakterien dagegen ist zu dünn, um der Lauge Widerstand zu leisten. Die Zellen brechen auf, und die DNA wird freigesetzt. Wird die Nadel durch diese Lösung gezogen, zeigt sich aufgrund der erhöhten Viskosität durch die freigesetzte DNA eine Fadenbildung.

Aminopeptidasetest

Der Aminopeptidasetest beruht darauf, dass das Enzym L-Alaninaminopeptidase, von wenigen Ausnahmen abgesehen, nur bei gramnegativen Bakterien nachgewiesen werden kann. Eine kleine Menge der zu untersuchenden Bakterien wird in einem Reagenzglas in etwas sterilem, destilliertem Wasser suspendiert. Zum Nachweis wird ein farbloses Substrat zugegeben, welches durch Spaltung einer Amidbindung durch die Aminopeptidase in Alanin und ein farbiges Molekül übergeht. Somit zeigt eine Färbung der Suspension das Vorhandensein eines gramnegativen Bakteriums an.

Historisches

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Der dänische Mediziner (Hans) Christian Gram entwickelte die Färbemethode als Mitarbeiter bei Carl Friedländer in Berlin. Er suchte nach einer Färbemethode, mit der Bakterien in tierischen Geweben dargestellt werden können, also kontrastierend zu den Gewebezellen gefärbt wurden. Die gefundene Färbemethode, veröffentlicht 1884, hatte jedoch nur bei einigen Bakterien, den grampositiven, Erfolg. Emile Roux wendete die Methode zur färberischen Differenzierung von grampositiven und gramnegativen Bakterien an, insbesondere zur Identifizierung von Gonokokken (gramnegativ im Gegensatz zu vielen anderen Kokken) (Veröffentlichung 1886).

Mikrobiologische Färbung

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