In Babylon ergriff der chaldäische General Nabopolassar (in anderer Schreibweise Nabû-polassar) diese Gelegenheit und bestieg 626 den Thron. Mit ihm begann das Neubabylonische Reich.
Nebukadnezar ließ die Tempel in allen Städten des Landes wieder aufbauen, errichtete Kanäle, die sogenannte Medische Mauer und die Prozessionsstraße mit dem Ischtar-Tor. Er förderte den Ackerbau, den Gartenbau und den Handel, sodass sich die Wirtschaft rasch erholte und aufblühte.
Mit Syrien und Israel führte Nebukadnezar Krieg, um sein Reich abzusichern. Die unterworfenen Länder wurden tributpflichtig und hatten hohe Abgaben zu entrichten. Israel versuchte mehrere Aufstände, die alle blutig niedergeschlagen wurden und schließlich dazu führten, dass Jerusalem vollkommen zerstört wurde. Zur Strafe wurde die Bevölkerung als Sklaven nach Babylon verschleppt (siehe auch die Bibel, 2. Kön. 24,14-16) und die Schätze des salomonischen-Tempels als Kriegsbeute mitgenommen. Es ist der Beginn der babylonischen Gefangenschaft der Juden, die erst in der Perserzeit ihr Ende nimmt.
Im Jahre 562 starb Nebukadnezar und hinterließ seinem Sohn Amell-Marduk ein wohlgeordnetes und konsolidiertes Reich. Nach nur zwei Jahren wurde Amell-Marduk bei einem Aufstand getötet und der babylonische General Neriglissar bestieg den Thron. Starke Streitigkeiten mit der Priesterschaft führten schließlich dazu, dass sich 555 Nabonid durch einen Aufstand des Throns bemächtigte. Nabonid war Anhänger des Gottes Sin und wollte die Macht der Marduk-Priesterschaft eindämmen. Das brachte ihm heftige Auseinandersetzungen bei der Neuordnung des Landwirtschafts- und Pachtsystems ein.
Außenpolitisch verhielt sich Nabonid neutral, als die Perser gegen die herrschenden Meder einen Aufstand wagten. Als Dank übergab ihm der Perserkönig Kyros II. nach dem Sieg die Heimatstadt seiner Mutter. Nachdem die Perser auch die Lydier bezwungen hatten, war Babylonien vom Persischen Reich eingeschlossen. Sie regierten das Gebiet zwischen dem Mittelmeer und dem Persischen Golf. Nabonid wollte durch strategische Maßnahmen der drohenden Gefahr entgegenwirken. So überließ er den Schutz des Reiches seinem Sohn Belsazar, der riesige Truppenkontigente befehligte, während er sich selbst in eine Oase in der arabischen Wüste zurückzog. Dadurch kontrollierte er die wichtigen Handelswege und konnte wirtschaftlichen Druck auf Ägypten ausüben. Die Gefahr durch die Araber nutzte er, um alle semitischen Stämme zu vereinigen.
In Babylon war der Zwist zwischen dem König und der Priesterschaft schon weit gediehen. Die Perser hatten ihren Ruf, tolerant zu sein und nationale Tradition zu respektieren, in die Stadt getragen. In Abwesenheit von Nabonid begingen die Priester Verrat. Nach einer kurzen Schlacht, bei der Belsazar besiegt wurde, marschierten die Perser gegen Babylon. Am 16. Oktober 539 marschierten die Truppen ohne Gegenwehr in Babylon ein. Am 29. Oktober zog Kyros II. unter Triumph und Jubel der Priesterschaft in der Stadt ein und wurde sofort als Machthaber eingesetzt. Kyros leitet eine neue Politik der Duldsamkeit ein und gab den Städten ihre Götter wieder zurück. Den Juden gestattet er, nach Jerusalem zurückzukehren.
Die Perser erkannten die Vorteile der Entwicklungen unter Nebukadnezar und wussten sie nutzbringend einzusetzen. Die aramäische Sprache Verkehrssrache. Die Wissenschaftler nutzten aber weiterhin die akkadische Sprache und die Keilschrift. Viele Gelehrte aus Ägypten, Persien, Indien und Griechenland kamen, um ihr Wissen zu erweitern. Im 5. Jahrhundert v. Chr. errechneten die Astronomen Babylons das Sonnenjahr und entwickelten im Jahre 410 das erste Horoskop. Während dieser Zeit wurde aus den Astrallehren der Babylonier die chaldäische Astrologie entwickelt, die später den Boden für die hellenistische bildete.
Alexander der Große traf während der Expansion seines Reiches 331 auf die persischen Streitkräfte und besiegte sie endgültig in der Schlacht von Issos und Gaugamela. Die Griechen tolerierten weiterhin die babylonische Kultur und erweiterten sie um Theater und zusätzliche Errungenschaften. Nach dem Tode Alexander des Großen verwüsteten Kriege der zerstrittenen Heerführer das gesamte Gebiet. Plünderung und Zerstörung sorgten für eine elende Hungersnot unter der Bevölkerung. Im 1. Jahrhundert v. Chr. übernahmen die Parther die Macht in Mesopotamien und beendeten die fast zweitausend jährige Existenz Babyloniens.
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