Gentherapie

Mit Gentherapie bezeichnet man das Einfügen von Genen in Zellen oder Gewebe eines Individuums zur Behandlung von bestimmten Erbkrankheiten bzw. Gendefekten. Durch die Einführung dieses Gens soll ein genetischer Defekt kompensiert werden. Ein genetischer Defekt liegt vor, wenn bei einem Lebewesen ein Gen nicht vorhanden ist oder die beabsichtigte Funktion nicht erfüllt. Die Gentherapie ist eine relativ neue Methode und wird bisher nur mit begrenztem Erfolg eingesetzt.

Voraussetzungen

Bei einer Gentherapie werden dem Körper einige Zellen entnommen. Diese Zellen erhalten das neue (therapeutische) Gen und werden danach wieder in den Körper eingebracht. Für die Anwendung der Gentherapie ergeben sich verschiedene Beschränkungen:

Gentherapie kann nur auf ein einzelnes gestörtes Gen („monogene Fehlfunktion“) angewandt werden, das außerhalb des Körpers bereits als intakte, klonierte Version vorliegt.

Die Chancen für den erfolgreichen Austausch eines defekten Gens gegen ein therapeutisches (funktionsfähiges) Gen stehen etwa 1 : 1000 (ungezielter Transfer). Der Einbau eines zusätzlichen gesunden Gens an anderer Stelle („Genaddition“), das die Funktion des defekten Gens verstärkt, kann nur bei Gering- oder Nichtproduktion des fraglichen Proteins angewendet werden, nicht jedoch bei Überproduktion oder schädlicher Fehlproduktion durch das defekte Gen.

Methoden

Für den ungezielten Transfer gibt es verschiedene Methoden (Vektoren), um ein therapeutisches Gen in eine Zelle zu transportieren:

Transfektion (chemisch): Die therapeutischen Gene und eine elektrisch geladene Verbindung (z.B. Calciumphosphat) werden zu den Zellen gegeben. Die elektrisch geladene Verbindung stört die Struktur der Zellmembran, wodurch die neue DNA ins Zellinnere gelangen kann. Die Chancen für einen erfolgreichen Einbau der DNA stehen mit dieser Methode bei 1:1000 - 1:100000.
Transfektion (physikalisch): Die Mikroinjektion bietet hohe Chancen für einen erfolgreichen Einbau des Gens (ca. 1:5), jedoch muss jede Zelle einzeln behandelt werden.
Transfektion (physikalisch): Bei der Elektroporation macht ein Stromstoß die Zellmembran vorübergehend durchlässig, so dass die neue DNA in die Zelle eindringen kann. Bei dieser Methode können jedoch die Zellen stark geschädigt werden.
Transfektion (physikalisch): Mit der Particle gun werden kleine Goldkügelchen in die Zelle geschossen, auf deren Oberfläche die therapeutischen Gene haften. Vorteil: Das importierte Gen wirkt exakt an der richtigen Stelle ohne toxisch zu sein. Nachteil: Auch diese Methode kann schwere Zellschäden hervorrufen.
Transduktion: Hierbei bringt ein Virus das therapeutische Gen in die Zelle. Diese Methode eignet sich für die klinische Behandlung am besten. Nachteil: Die Virusbestandteile können toxisch sein.

Bei der Transduktion gibt es mehrere mögliche Transportviren:

therapeutisches Gen liegt bereits als DNA vor

begrenztes Fassungsvermögen
dringen nur in (wenige) bestimmte Zellen ein

!RNA-Viren

großes Fassungsvermögen
infizieren viele verschiedene Zelltypen

RNA baut sich in der Zelle schnell ab, da sie nicht in DNA umgeschrieben wird

!Retroviren

großes Fassungsvermögen
infizieren viele verschiedene Zelltypen
RNA wird in DNA umgeschrieben und ins Erbgut der Wirtszelle eingebaut

brauchen teilungsaktive Zellen (z.B. keine Nervenzellen)
können bei ihrer Vermehrung im Körper Krebs auslösen

	Vorteile	Nachteile	-	DNA-Viren			-			-

Vermehrungszyklus von Retroviren: Heftet sich ein Hüllprotein eines Retrovirus an einen Rezeptor auf einer Zellmembran, entlässt das Virus bestimmte Proteine (Reverse Transkriptase) und seine RNA in die Zelle. Die typische Retroviren-RNA hat folgenden Aufbau:

Name	R-U5	ψ (psi)	gag	pol	env	U3-R	-	Länge (bp)	90-180	???	ca. 2000	ca. 2900	ca. 1800	170-1260	-	codiert	5'-Ende	"Startsequenz" zur Herstellung viraler RNA aus dem Provirus	Proteine des Kernbereichs	Reverse Transkriptase Endonuclease Protease	Virushülle	3'-Ende

Im Cytoplasma der Zelle schreibt die Reverse Transkriptase die virale RNA in eine DNA mit verlängerten Endabschnitten um. Diese langen terminalen Repetitionen (LTRs) beeinflussen die Aktivität der Virusgene und erleichtern den Einbau der viralen DNA in die Erbsubstanz der Zelle. Diese (seit dem Einbau Provirus genannte) DNA kann jetzt die viralen Proteine und die virale RNA (aus sich selbst) bilden, welche dann zu einem neuen Virus zusammengebaut werden und die Wirtszelle durch Knospung verlassen.

Die Retroviren haben sich als bisher bester Vektor erwiesen. Um aus einem Retrovirus einen sicheren Vektor herzustellen, sind mehrere Schritte nötig: In einem Provirus werden die viralen Gene (die den Aufbau des Virus codieren) durch das therapeutische Gen ersetzt. Dabei bleibt die virale ψ (psi)-Region, die dafür sorgt, dass die DNA in virale RNA ungewandelt werden kann, erhalten.

Das therapeutische Provirus (ψ⁺) wird in eine "Verpackungszelle" eingebracht. In der Erbinformation dieser Zelle befindet sich ein Helfer-Provirus, dem der ψ-Abschnitt fehlt.
Das therapeutische Provirus stellt eine ψ⁺-RNA her.
Das Helfer-Provirus stellt virale Proteine und eine unverpackbare ψ^--RNA her.
Die therapeutische ψ⁺-RNA wird nun mit den nötigen viralen Proteinen in die durch das Helfer-Provirus erzeugte Virushülle eingelagert und aus der Verpackungszelle ausgeschleust. Dieser neue Virus ist ein sicherer Vektor, da er sich nicht mehr vermehren kann.
"Infiziert" dieser neue Virus eine Zelle, so wird lediglich das therapeutische Gen in die Zell-DNA eingebaut. Es kann weder virale RNA noch virale Proteine erzeugen, sondern nur das gewünschte (bisher fehlende) Protein.

Körperzellen, die für eine Gentherapie mit Retroviren als Vektor in Frage kommen, müssen bestimmte Anforderungen erfüllen:

Sie müssen widerstandsfähig genug sein, um die "Infektion", besonders aber die Entnahme aus und die Wiedereinpflanzung in den Körper zu überstehen
Sie müssen leicht entnehmbar und wieder einsetzbar sein
Sie sollten langlebig sein, damit sie das neue Protein über lange Zeit hinweg produzieren können

Folgende Zelltypen haben sich als geeignet erwiesen:

Hautzellen: Fibroblasten aus der Lederhaut (nicht mehr aktuell)
Leberzellen
T-Zellen: T-Lymphocyten (zirkulierende weiße Blutkörperchen) sind für die zelluläre Immunantwort zuständig. Das Fehlen des Gens für Adenosindesaminase (ADA), das zu einem "schweren kombinierten Immundefekt" (SCID, Severe Combined Immunodeficiency) führt, wird durch entsprechende Behandlung dieser Zellen therapiert. Eine weitere Therapiemöglichkeit ist ein Defekt in der gemeinsamen Kette einiger Interleukinrezeptoren, X-SCID.
Knochenmarkszellen: Sie produzieren die roten und weißen Blutkörperchen. Durch Gentherapie der seltenen Stammzellen lassen sich genetisch bedingte Krankheiten des Blutes und des Immunsystems behandeln. So ließe sich z.B. die Beta-Thallassämie (ein Mangel an b -Globin führt zu Anämie (Blutarmut)) durch Einbau einer "Verstärkersequenz" in Stammzellen behandeln.

In Deutschland wurden seit September 2002 alle klinischen Studien mit retroviralen Genvektoren wegen der aufgetretenen Nebenwirkungen zeitweilig ausgesetzt und hinsichtlich ihrer Sicherheit neu bewertet.

Anwendungen am Patienten

Therapie von SCID

Am 14. September 1990 wurde von Ärzten des US-amerikanischen Bundesgesundheitsinstituts an einem vierjährigen Mädchen die weltweit erste gentherapeutische Behandlung durchgeführt. Die Patientin Ashanti DeSilva litt an einem schweren kombinierten Immundefekt (SCID), eine sehr seltene Krankheit (Inzidenz 1:100.000), verursacht durch einen schweren Defekt sowohl des T- als auch des B-Lymphozytensystems. Bei von diesem Defekt betroffenen Patienten ist das Immunsystem in seiner Funktion erheblich bis vollständig beeinträchtigt, d.h. es gibt wenig oder gar keine Immunantwort - schon eine Erkältungskrankheit kann für die Kinder den Tod bedeuten. Die Gentherapie, die aufgrund der begrenzten Lebensdauer der Leukozyten mehrmals im Jahr wiederholt werden muss, ermöglicht den Patienten ein Leben ohne strikte Quarantäne. Der Gentherapie an Ashanti DeSilva ging ein dreijähriges Genehmigungsverfahren voraus.

Die von den Symptomen her identische Erkrankung X-SCID, die auf Grund von Mutationen in der gemeinsamen Kette einiger Interleukinrezeptoren auftritt (γc, CD132), wurde ebenfalls mit einem gentherapeutischen Ansatz von Alain Fischer in Paris behandelt. Nachdem die Behandlung zunächst größtenteil erfolgreich verlief, traten bei einigen Patienten nach einiger Zeit Leukämien auf (näheres siehe X-SCID).

Therapie von Septischer Granulomatose

Am 2. April 2006 wurde vom Georg-Speyer-Haus in Frankfurt am Main die Behandlung von zwei Erwachsenen und einem Kind bekannt gegeben, die an der seltenen Krankheit Septische Granulomatose im Endstadium litten. Einer der beiden in Frankfurt behandelten Patienten verstarb wenige Tage später an den Folgen einer Blutvergiftung. Ob es einen Zusammenhang zwischen dem Tod des Mannes und der Gentherapie gibt, ist unklar.

Methodik

In der Frankfurter Studie (Leitung: Prof. Dieter Hoelzer, Durchführung: Dr. Marion Gabriele Ott) waren zunächst blutbildende Stammzellen (CD34+) aus dem Blut der beiden Patienten entnommen, im Labor mit einer funktionsfähigen Kopie des bei den Patienten defekten Gens ausgestattet und dann wieder ins Blut der Patienten infundiert worden. Als Gen-Fähre wurde ein inaktiviertes Maus-Retrovirus benutzt. Bei beiden Patienten kam es zur erhofften dauerhaften Ansiedlung der gentechnisch veränderten Stammzellen in ihrem Körper, zu deren Vermehrung und zu deren Differenzierung zu Phagozyten ("Fresszellen").

Die Besonderheit des Frankfurter Vorgehens bestand darin, die Patienten vor der Übertragung der modifizierten Blutstammzellen einer milden Leukämie-Chemotherapie zu unterziehen. Die hierdurch verursachte Reduzierung von Blutstammzellen erleichterte später offenbar die Integration der gentechnisch veränderten Blutstammzellen ins Knochenmark der Patienten. Noch im Jahr 2006 soll in Frankfurt am Main damit begonnen werden, zehn weitere schwerstkranke Patienten in gleicher Weise gentherapeutisch zu behandeln. Bis April 2006 hatten die Ärzte rund eine Million Euro an Forschungsgeldern für Vorbereitung und Durchführung des Therapieversuchs aufgewendet. Dem Beginn der Gentherapie war ein fast sechs Jahre dauerndes Genehmigungsverfahren voraus gegangen.

Heilerfolge

Innerhalb von 50 Tagen besserte sich der Zustand der Patienten, die zuvor an therapieresistenten Bakterien- und Pilzinfektionen gelitten hatten, erheblich. Etwa 150 Tage nach der Infusion nahm bei beiden Patienten allerdings die Zahl der genetisch korrigierten Zellen noch einmal zu. Molekularbiologische Kontrolluntersuchungen zeigten, dass diese Veränderungen durch eine zusätzliche, unerwartete Aktivierung von drei Genen durch die virale Gen-Fähre zurückzuführen war, die nun das Zellwachstum stimulierten. Daher wurden zunächst keine weiteren Patienten mit dieser Methode behandelt, da die Ärzte das Risiko des Entstehens einer Leukämie nicht sicher ausschließen konnten. Die Studie wurde nach Angaben der Autoren 16 Monate nach Beginn des ersten Therapieversuchs in der Fachzeitschrift Nature Medicine veröffentlicht, da dieser beobachtete Effekt bis dahin ohne negative Folgen geblieben war.

Die beiden Frankfurter Patienten waren zum Zeitpunkt des Gentherapie 26 bzw. 25 Jahre alt. Bei dem 26jährigen Mann war im Alter von 2 1/2 Jahren die erste Diagnose auf septische Granulomatose gestellt worden. Er hatte mehrere lebensgefährliche bakterielle Infektionen überstanden und litt seit 1980 an Leberabszessen, die seit 2003 therapieresistent waren. Ferner hatte er 2002 im ganzen Körper schwere Knochenhautentzündungen, die erst nach Monaten abgeklungen waren. Bei dem 25jährigen Mann war die Krankheit im Alter von einem Jahr diagnostiziert worden. Seit 2002 litt er an therapieresistenten Pilzinfektionen der Lunge, auch war bei ihm generell die Wundheilung gestört.

Beide Patienten konnten einen Monat nach der Stammzellübertragung das Krankenhaus verlassen und hatten danach keine schweren Bakterien- oder Pilzinfektionen mehr. 53 Tage nach Zuführung der gentechnisch veränderten Blutstammzellen war bei dem 26jährigen Patienten der Leberabszess röntgenologisch nicht mehr nachweisbar. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung der Studie im April 2006 musste er keine Medikamente zum Schutz vor Infektionen mehr einnehmen. Beim 25jährigen Patienten war die Pilzinfektion der Lunge nach 50 Tagen nahezu abgeklungen, später verschwand sie ganz. Ein Jahr nach seiner Gentherapie (im April 2006) nahm er noch in geringer Menge vorbeugend Antibiotika ein. Bei beiden Patienten wiesen schon ein Monat nach der Gentherapie ca. 20 bzw. 10 Prozent der Granulocyten das funktionstüchtige Gen auf. Infolge der späteren, unerwarteten Genaktivierung stieg ihre Zahl später auf 60 bzw. 50 Prozent an. Nach Angaben der Ärzte würden bereits 5 Prozent funktionstüchtige Zellen genügen, um die Immunabwehr wiederherzustellen.

Noch dramatischer war der Heilungserfolg bei einem fünfjährigen Jungen in Zürich, der gleichfalls im Frühjahr 2005 - aus einer akuten ärztlichen Notlage heraus - gemäß den Vorgaben der Frankfurter Studie von Prof. Reinhard Seger am Universitätsspital Zürich gentherapeutisch behandelt wurde. Infolge einer therapieresistenten Pilzinfektion der Lunge hatte dem Jungen bereits ein Lungenflügel entfernt werden müssen, dennoch war der Pilzbefall zum Rückenmarkskanal durchgebrochen und hatte eine Querschnittslähmung herbeigeführt. Schon wenige Wochen nach der Gentherapie war der Pilzbefall völlig beseitigt, und zur Überraschung der Ärzte klangen auch die neurologischen Beschwerden allmählich ab: Ein Jahr nach der Gentherapie war er sogar wieder in der Lage, auf einem Bein zu stehen und mit seiner Schwester zumindest kurzzeitig Fußball zu spielen.

Plötzlicher Todesfall

Am 27. April 2006 wurde bekannt, dass der zum Zeitpunkt des Eingriffs 26-jährige Mann am 10. April, also etwa zwei Jahre nach der Gentherapie, in Düsseldorf verstorben war. Nachdem er zunächst erstmals seit seiner Kindheit über Monate hinweg frei von schweren Infektionen gewesen war, war es bereits im Januar 2006 zu einer ersten Entzündung in seinem Kiefer gekommen. Danach musste ihm die Milz entfernt werden und es trat eine Entzündung des Dickdarms auf.

Zwei Tage vor seinem Tod war es bei diesem Patienten zu einem plötzlichen Darmdurchbruch, hierdurch zu schweren Infektionen im Bauchraum und in der Folge zu einem septischen Schock sowie zu einem Multiorganversagen gekommen. Die Ärzte erklärten diesen Krankheitsverlauf am 23. Mai 2006 in einer Presseerklärung so: "Die meisten der gentechnisch veränderten weißen Blutzellen haben ihre Funktion teils oder vollständig verloren. Bedauerlicherweise hat die Anzahl der restlichen funktionsfähigen genkorrigierten weißen Blutzellen nicht mehr ausgereicht, Keime einer Infektion dieser Schwere noch erfolgreich zu bekämpfen." Warum die genveränderten Zellen verloren gingen, ist derzeit noch unklar. Den beiden anderen Patienten geht es einer Pressemitteilung der Ärzte vom 28. April 2006 zufolge weiterhin gut.

Literatur: Marion G. Ott, Manfred Schmidt u.a.: Correction of X-linked chronic granulomatous disease by gene therapy, augmented by insertional activation of MDS1-EVI1, PRDM16 or SETBP1. Nature medicine, advance online publication, 2. April 2006; doi:10.1038/nm1393

Literatur

Scientific American, November 1990, Inder M. Verma, "Gene Therapy"
D.T. Suzuki, A.J.F. Griffith, J.H. Miller, R.C. Lewontin, "Genetik", VCH Verlag, 1991
Benjamin Lewin, "Genes V", Oxford University Press, 1994
Deutsches Ärzteblatt 2003; 100: A 314–318 6
Human Gene Therapy, September 2005, 16:1014, "Gendicine: The First Commercial Gene Therapy Product" (und [http://www.liebertonline.com/doi/pdfplus/10.1089/hum.2005.16.1016)
A.M. Raem, R.W. Braun, H. Fenger, W. Michaelis, S. Nikol, S.F. Winter, "Genmedizin, Eine Bestandsaufnahme", Springer-Verlag 2001

Weblinks

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